მუხლი 19. 1. მსხვილფეხა საქონლის ენზოოტიური ლეიკოზის ტესტები ტარდება ამ მუხლის მე-2-მე-13 პუნქტებით განსაზღვრულ პირობებში აგარის გელზე იმუნოდიფუზიის მეთოდის (AGID) გამოყენებით ან ამ მუხლის მე-14-მე-16 პუნქტებით

2. მსხვილფეხა საქონლის ენზოოტიური ლეიკოზისთვის აგარის გელზე იმუნოდიფუზიის ტესტში  გამოსაყენებლი ანტიგენი შეიცავს მსხვილფეხა საქონლის ლეიკოზის ვირუსის გლიკოპროტეინს. ანტიგენის  სტანდარტიზაცია ხდება E05 შრატთან მიმართებაში.

3. ლაბორატორია პასუხისმგებელია  მსხვილფეხა საქონლის ენზოოტიური ლეიკოზის ტესტების დაიგნოზის სტანდარტებისა და მეთოდების კოორდინაციაზე სტანდარტული მუშა ანტიგენის კალიბრაციაზე E05 შრატთან მიმართებაში.

4. ტესტების რეაგენტების  შედგენილობაა:

ა) ანტიგენი, რომელიც შეიცავს მსხვილფეხა საქონლის ენზოოტიური ლეიკოზის ვირუსის სპეციფიურ გლიკოპროტეინს და რომელიც სტანდარტიზებულია E05 შრატთან მიმართებაში;

ბ) სატესტო შრატი;

გ) ცნობილი  დადებითი საკონტროლი შრატი;

დ)  აგარის გელი:

დ.ა) 0,8% აგარი;

დ.ბ) 8,5 % NaCl;

დ.გ) 0,05M ტრის-ბუფერი pH 7,2,დ.დ) ამ აგარის 15 მლ უნდა მოთავსდეს 85მმ დიამეტრის პეტრის ჭურჭელში, რის შედეგადაც ჭურჭლის სიღრმის  2,6 მმ აგარით ივსება.

5. ტესტის ნიმუშისთვის პეტრის ფინჯანზე განთავსებულ აგარის გელში კეთდება (იჭრება) შვიდი მშრალი ბუდე; ნიმუში შედგება ერთი ცენტრალური ბუდისგან, ხოლო ექვსი ბუდე განლაგებულია წრეზე მის გარშემო, სადაც:

ა) ცენტრალური ბუდის დიამეტრია 4 მმ;

ბ)  პერიფერული ბუდეების დიამეტრია 6 მმ;

გ) ცენტრალური ბუდესა და  პერიფერულ ბუდეებს შორის მანძილია 3 მმ.

6. ცენტრალური ბუდე ივსება სტანდრატული ანტიგენით. დანართი N1-ით  ,,პეტრის ფინჯანზე ბუდეების  განლაგება“ განსაზღვრული პერიფერული ბუდეები 1 და 4 ივსება ცნობილი დადებითი შრატით; ბუდეები 2, 3, 5 და 6 – სატესტო შრატებით. ბუდეების შევსება ხდება  ზედაპირზე ჩაღრმავების გაქრობამდე.

7. ამ მუხლის მე-6 პუნქტში აღწერილი პროცედურის შედეგად მიიღება შემდეგი ოდენობები:

ა)  ანტიგენი: 32 μl;

ბ) საკონტროლი შრატი: 73 μl;

გ)  სატესტო შრატი: 73 μl.

8. ინკუბაცია მიმდინარეობს 72 საათის განამვლობაში ოთახის ტემპერატურაზე (20 - 27°C )  დახურულ ტენიან კამერაში.

9. ტესტის წაკითხვა შესაძლებელია 24 და 48 საათზე, მაგრამ საბოლოო შედეგი არ მიიღება 72 საათის გასვლამდე და:

ა)   სატესტო შრატი დადებითია, თუ ის ქმნის ნალექის  სპეციფიკურ ხაზს მსხვილფეხა საქონლის ლეიკოზის ვირუსის ანტიგენთან და ქმნის იდენტურობის სრულ ხაზს საკონტროლო შრატთან;

ბ)  სატესტო შრატი უარყოფითია, თუ ის არ ქმნის ნალექის სპეციფიკურ ხაზს მსხვილფეხა საქონლის ლეიკოზის ვირუსის ანტიგენთან და თუ არ ამრუდებს საკონტროლო შრატის ხაზს;

გ) რეაქცია საეჭვოდ ითვლება, თუ ის:

გ.ა) ამრუდებს საკონტროლო შრატის ხაზს მსხვილფეხა საქონლის ლეიკოზის ვირუსის ანტიგენის ბუდისკენ ანტიგენთან კარგად გამოხატული ნალექის ხაზის შექმნის გარეშე;

გ.ბ) ან თუ ის არ იკითხება, როგორც უარყოფითი ან როგორც დადებითი.

დ) საეჭვო რეაქციების დროს ტესტი შეიძლება ჩატარდეს განმეორებით და გამოყენებული იქნეს კონცენტრირებული შრატი.

10. შესაძლებელია გამოყენებულ იქნას ბუდეების სხვა ნებისმიერი კონფიგურაცია ან მოდელი თუ E05 შრატი გახსნილი უარყოფით შრატთან 1:10 შეიძლება ჩაითვალოს  დადებითად.

11. ანტიგენის სტანდარტიზაციის მეთოდისთვის აუცილებელი მასალა და სხნარებია:

ა) 1,6 % აგაროზის 40 მლ 0,05 M Tris/HCl ბუფერში,  pH 7,2,  8,5 % NaCl -თან;

ბ) 15 მლ მსხვილფეხა საქონლის ლეიკოზის შრატი, რომელსაც ანტისხეული გააჩნია მხოლოდ მსხვილფეხა საქონლის ლეიკოზის ვირუსის გლიკოპროტეინებთან, 1:10 გახსნილი 0,05 M Tris/HCl ბუფერში, pH 7,2,  8,5 % NaCl -თან;

გ)  15 მლ მსხვილფეხა საქონლის ლეიკოზის შრატი, რომელსაც ანტისხეული გააჩნია მხოლოდ მსხვილფეხა საქონლის ლეიკოზის ვირუსის გლიკოპროტეინებთან, 1:5 გახსნილი 0,05 M Tris/HCl ბუფერში, pH 7,2,  8,5 % NaCl -თან;

დ) პლასტმასის ოთხი 85 მმ დიამეტრის პეტრის ფინჯანი;

ე)   4-6მმ დიამეტრის პერფორატორი;

ვ)  ეტალონი ანტიგენი;

ზ) ანტიგენი, რომლის სტანდარტიზაციაც უნდა მოხდეს;

თ) წყლის აბაზანა (56 °C).

12. ანტიგენის სტანდარტიზაციის მეთოდის პროცედურაა:

ა) აგაროზი (1,6 %) იხსნება  ტრის/HCl ბუფერში 100 °C -მდე გაცხელებით. თავსდება 56°C წყლის აბაზანაში დაახლოებით 1 საათის განმავლობაში. ასევე, 56°C წყლის აბაზანაში თავსდება მსხვილფეხა საქონლის ლეიკოზის შრატის ხსნარი;

ბ) შემდეგ შერევა ხდება 15 მლ 56°C აგაროზის ხსნარის 15 მლ მსხვილფეხა საქონლის ლეიკოზის შრატთან(1:10),  უნდა შეინჯღრეს სწრაფად და 15-15 მლ ისხმება პეტრის ორივე ფინჯანში. აღნიშნული პროცედურა მეორდება მსხვილფეხა საქონლის ლეიკოზის შრატით (1:5);

გ) როცა აგაროზა გამყარდება, მასში კეთდება ღრმულები ამ ტექნიკური რეგლამენტის დანართის N1 შესაბამისად;

დ) ანტიგენის დამატება:

დ.ა) პეტრის ფინჯანი №1 და №3:

დ.ა.ა) ბუდე ა – განუზავებლი ანტიგენის ეტალონი;

დ.ა.ბ) ბუდე ბ – 1:2 განზავებული ანტიგენის ეტალონი;

დ.ა.გ) ბუდეები გ და ე – ეტალონი ანტიგენი;

დ.ა.დ)  ბუდე დ – განუზავებელი ტესტ-ანტიგენი;

დ.ბ) პეტრის ფინჯანი №2 და №4:

დ.ბ.ა)   ბუდე ა – განუზავებელი ტესტ-ანტიგენი;

დ.ბ.ბ)  ბუდე ბ – 1:2 განზავებული ტესტ-ანტიგენი;

დ.ბ.გ) ბუდე გ — 1:4 განზავებული ტესტ-ანტიგენი;

დ.ბ.დ) ბუდე დ — 1:8 განზავებული ტესტ-ანტიგენი.

13.  ანტიგენის სტანდარტიზაციის მეთოდისთვის  დამატებითი მოთხოვნებია:

ა) ცდა ტარდება შრატის 2 ხსნარით (1:5 და 1:10) ოპტიმალური ნალექის მისაღებად;

ბ) თუ ნალექის  დიამეტრი ორივე ხსნარით ძალიან პატარაა, მაშინ შრატი კიდევ უნდა გაიხსნას;

გ) თუ ნალექის დიამეტრი ორივე ხსნარში ძალიან დიდია და შეუმჩნეველი (მკრთალი), მაშინ უნდა შეირჩეს უფრო მცირე დოზის შრატი;

დ) აგაროზას საბოლოო კონცენტრაცია უნდა იყოს 0,8%,  შრატის კი  შესაბამისად - 5% და 10%;

ე) გაზომილი დიამეტრები უნდა მოინიშნოს დანართი №2-ით „საკოორდინატო სისტემა“ განსაზღვრულ საკოორდინატო სისტემაზე.  საცდელი ანტიგენის ხსნარი, რომლის დიამეტრიც ეტალონი ანტიგენის დიამეტრის ტოლია, წარმოადგენს სამუშაო ხსნარს.

14. მსხვილფეხა საქონლის ენზოოტიური ლეიკოზის დასადგენად მყარფაზიანი იმუნოფერმენტული ანალიზის (ELISA) დროს გამოსაყენებელი მასალა და რეაგენტები:

ა)  მყარფაზიანი მიკროპლანშეტები, კიუვეტები ან სხვა რომელიმე მყარი ფაზა;

ბ) ანტიგენი, რომელიც მაგრდება მყარ ფაზაზე პოლიკლონური ან მონოკლონური ანტისხეულების დახმარებით ან მათ გარეშე. თუ ანტიგენი დაგრუნტულია პირდაპირ მყარ ფაზასთან, ყველა სატესტო ნიმუში, რომელმაც დადებითი რეაქცია აჩვენა, ხელახლა უნდა შემოწმდეს საკონტროლო ანტიგენის მიმართ. საკონტროლო ანტიგენი ანტიგენის იდენტური უნდა იყოს, გარდა იმისა, როდესაც მსხვილფეხა საქონლის ლეიკოზის ვირუსის ანტიგენები არ გვაქვს სახეზე. თუ დაავადების გამომწვევი ანტისხეულები დაგრუნტულია მყარ ფაზასთან, ანტისხეულები მსხვილფეხა საქონლის ლეიკოზის ვირუსის ანტიგენების გარდა სხვა ანტიგენზე არ რეაგირებენ;

გ) ბიოლოგიური სითხე, რომელიც უნდა შემოწმდეს;

დ)  შესაბამისი დადებითი და უარყოფითი კონტროლი;

ე)  შეწყვილება (კონიუგირება);

ვ)  გამოყენებულ ენზიმთან ადაპტირებული სუბსტრატი;

ზ)  შემაჩერებელი ხსნარი, საჭიროების შემთხვევაში;

თ) ტესტის ნიმუშების გამხსნელი ხსნარები გასარეცხად და რეაგენტების მოსამზადებლად;

ი)  გამოყენებული სუბსტრატის  წაკითხვის შესაბამისი სისტემა.

15. ELISA-ს მგრძნობელობა იმ დონის უნდა იყოს, რომ E05 შრატმა აჩვენოს დადებითი, ცალკეული ნიმუშებიდან მიღებულ ხსნართან შედარებით 10-ჯერ (შრატის ნიმუშები) ან 250-ჯერ (რძის ნიმუშები) მეტად განზავებისას, როცა ეს ნიმუშები შედის ნაზავში. ისეთ ანალიზში, რომელშიც ნიმუშები (შრატის და რძის) მოწმდება ინდივიდუალურად,  E05შრატი, რომელიც  გახსნილია 1 /10 (უარყოფით შრატში) ან 1/ 250 (უარყოფით რძეში), უნდა შეფასდეს დადებითად, როცა მოწმდება იმავე ანალიზის ხსნარში, რომელიც გამოყენებული იყო ტესტის ცალკეული ნიმუშებისთვის. ლაბორატორია პასუხისმგებელია ELISA-ს ხარისხის შემოწმებაზე, განსაკუთრებით, პროდუქციის თითოეული პარტიისთვის E05 შრატისთვის მიღებული გამოთვლის საფუძველზე ნაზავში მოსათავსებელი ნიმუშების რაოდენობის განსაზღვრაზე.

16. მსხვილფეხა საქონლის ენზოოტიური ლეიკოზისთვის ELISA-ს  გამოყენების პირობებია:

ა)  ELISA-ს გამოყენება შეიძლება შრატისა და რძის ნიმუშებზე;

ბ) იქ,  სადაც ELISA გამოიყენება დამადასტურებელი მიზნებისთვის ამ ტექნიკური რეგლამენტის მე-6 მუხლის მე-2 პუნქტის ,,გ“ ქვეპუნქტის შესაბამისად ან ჯოგის სტატუსის დასადგენად ან შესანარჩუნებლად ამ ტექნიკური რეგლამენტის მე-18 მუხლის მიხედვით, შრატის ან რძის ნიმუშების განზავება უნდა მოხდეს ისე, რომ შესამოწმებელი ნიმუშები დანამდვილებით წარმოადგენდეს იმ ცალკეული ცხოველის ნიმუშს, რომელებიც ნაზავში მოათავსეს. ნებისმიერი დამადასტურებელი ტესტი უნდა ჩატარდეს ცალკეული ცხოველებიდან აღებულ ნიმუშებზე.

გ) იქ,  სადაც ELISA გამოიყენება მოგროვებული რძის ნიმუშზე, აღნიშნული ნიმუში აღებული უნდა იქნეს ისეთი ჯოგიდან მოგროვებული რძიდან, რომელშიც სულ მცირე 30% მეწველი ძროხაა. ნებისმიერი დამადასტურებელი ტესტი უნდა ჩატარდეს ცალკეული ცხოველებიდან აღებული შრატის ან რძის ნიმუშებზე.

დაავადებე